本文標題：" 測量細胞培養液中LDH活性的原理"
發布者：yiyi ------ 分類: 站內動態 ------ 人瀏覽過 -----時間：2012-11-12 23:50:48
測量細胞培養液中LDH活性的原理
細胞死亡率之測定
乳酸去氫醣（lactate dehydrogenase, LDH）為存在細胞漿中之穩定物質。
當細胞損傷時，細胞膜的完整性被破壞，導致 LDH 釋放到細胞外的培養液
中；而LDH的釋放量與細胞損傷程度具有正相關性。因此，藉由測量細胞培養液中 LDH 活性的高
低以代表細胞的死亡率
一、原理
當 LDH 將丙酮酸轉變成乳酸時，還原性輔助醣（NADH；波長
340 nm 有較高的吸光值）亦被氧化成氧化性輔醣（NAD；波長 340 nm
吸光值較低），此反應中具有吸光值之變化。因此，藉由觀察氧化還原
反應中，還原性輔醣之高吸光值隨時間漸減之趨勢而評估乳酸去氫脢的
活性（units/ml）
丙酮酸 + 還原性輔醣 LDH 乳酸 + 氧化性輔醣
（pyruvate） （NADH） （lactate） （NAD）
二、試劑
1. 0.1 M 磷酸緩衝液（Phosphate buffer；PBS）
2. 500 units/ml Enzyme Control 2-E：Sigma
3. 0.3μg/μl β–NADH 溶液
4. 22.7 mM 丙酮酸鈉溶液
三、標準品備制
將 500 units/ml Enzyme Control 2-E（LDH）以 0.1 M 磷酸緩衝液稀
釋成各種不同濃度（500, 250, 125, 62.5 units/ml）之 LDH 溶液，作為
標準品
實驗步驟
1. 取 50μl 樣品或標準品置于 96-well RIA/EIA plate 中，并加入 100μl
β-NADH 后，室溫下避光，反應 30 分鐘。
2. 各加入 100μl Sodium Pyruvate，立即（2 分鐘內）以 ELISA reader 進
行動力（kinatics）學方式分析測讀。設定波長 340 nm，共進行 3 分
鐘測讀，每 30 秒記錄一次吸光值；完成后，ELISA reader 將自動算
出單位時間內吸光值的變化率（△Abs/min），以估算 LDH 之活性。
一單位乳酸去氫醣之活性（1 unit of LDH activity）的定義是指每分鐘
催化 1 mmol NADH 氧化所需 LDH 的量
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